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血液维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
点击次数:4738 更新时间:2010-11-18

 

血液维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
 
主要用途
 
血液维生素B1液相色谱法定量检测试剂是一种旨在通过沉淀去除干扰,然后进行氧化衍生化,进而在液相色谱仪和荧光光谱下检测分析,分离出维生素B1波峰,以定量测定样品中TDP的含量而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于人体、动物等血液(红细胞、全血)样品中维生素B1检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
 
技术背景
 
维生素B1vitamin B1),又称为硫胺(thiamin),是一种B类复合物中的水溶性维生素,由嘧啶碱基(pyrimidine)和噻唑(thiazol)环通过亚甲桥(methylene bridge)链接而成。化学全名是2-[3-[(4-amino- 2-methyl- pyrimidin- 5-yl) methyl]- 4-methyl- thiazol- 5-yl] ethanol。其分子量为300.84,分子式为C12H17N4OS+Cl-。维生素B1对于碱性溶液、氧化反应和还原反应敏感。维生素B1由植物和微生物产生,以游离、肽结合、磷酯(phospho-ester)形式存在。而人体和动物通过食物获得补充,在胃肠组织通过主动运输和被动弥散予以摄入。其体内代谢中的活化分子为焦磷酸硫胺(thiamine diphosphate/thiamine pyrophosphateTDP)和三磷酸硫胺(thiamine triphosphateTTP),作为碳水化合物、脂肪、醇类和氨基酸代谢(氧化羧基化反应;oxidative carboxylation)的主要辅酶。活化分子去磷酸化后,经肾脏排出。全血中的90%或红细胞中80%的维生素B1TDP,因此检测血液中TDP含量成为体内维生素B1含量的主要指标。维生素B1缺乏,将导致脚气病(beriberi,而出现周围神经炎(peripheral neuritis)、肌无力、瘫痪和心血管系统症状。维生素B1的检测方法,首先沉淀去除大分子干扰,然后使用铁氰化钾(potassium ferricyanide),在碱性条件下,氧化硫胺及其衍生物为荧光三色(trichrome)衍生物,进而在液相色谱仪和荧光光谱仪下(激发波长365nm,散发波长440nm)检测分析,分离出维生素B1波峰,以定量维生素B1的含量
 
产品内容
 
清理液(Reagent A                                                                       毫升
裂解液(Reagent B                                                                            毫升
沉淀液(Reagent C                                                                       毫升
稀释液(Reagent D                                                                       毫升
碱性液(Reagent E                                                                        毫升
氧化液(Reagent F                                                                           毫升
流相液(Reagent G                                                                      毫升
标准液(Reagent H                                                                        毫升
产品说明书                                                                                                            1
 
保存方式
 
保存稀释液(Reagent D)、氧化液(Reagent F)和标准液(Reagent H)在-20冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里,氧化液(Reagent F避免光照;试剂具有挥发性,注意密闭瓶盖;沉淀液(Reagent C)、碱性液(Reagent D)、流相液(Reagent G)和标准液(Reagent H)具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证3月
 
用户自备
 
1.5毫升离心管:用于样品处理和标准液配制的容器
(微型)台式离心机:用于样品处理
恒温水槽或培养箱:用于样品反应孵育
液相色谱仪(HPLC):用于定量测定
 
实验步骤
 
一、样品准备
 
1)红细胞样品准备
1.   准备好EDTA抗凝管
2.   抽取1毫升血液,置于抗凝管里
3.   转移到1.5毫升离心管
4.   放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为200g
5.   小心抽去上清液
6.   加入xx毫升清理液(Reagent A,混匀
7.   放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为2000g
8.   小心抽去上清液
9.   重复实验步骤68二次
10.加入xx裂解液(Reagent B
11.强力涡旋震荡1分钟
12.加入xx微升沉淀液(Reagent C
13.涡旋震荡1分钟
14.4下孵育10分钟
15.放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g
16.小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
17.即刻进行后续衍生化和液相色谱分析(注意:如果暂时保存,建议在4不超过24小时;-20不超过3月)
 
2)全血样品准备
1.   准备好EDTA抗凝管
2.   抽取250升血液,置于抗凝管里
3.   转移到1.5毫升离心管
4.   加入xx裂解液(Reagent B
5.   强力涡旋震荡1分钟
6.   加入xx微升沉淀液(Reagent C
7.   涡旋震荡1分钟
8.   4下孵育10分钟
9.   放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g
10.小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
11.即刻进行后续衍生化和液相色谱分析(注意:如果暂时保存,建议在4不超过24小时;-20不超过3月)
二、测定准备
 
1.     开启仪器预热15分钟
2.     根据下表设置液相色谱仪(HPLC)参数
 

参数
推荐三
补充说明
色谱柱
长度:12.5cm
直径:4.0mm
Waters仪器或
Agilent仪器
固定相
ODS
 
流动相
流相液(Reagent G
流速
1毫升/分钟
 
注射容量
50微升
10微升至100微升
检测
荧光
 
波长
激发波长365nm,散发波长440nm
 
柱温
30
 
峰值时间(retention
3.5分钟
参考
运行时间
12分钟
参考

 
3.   使用流相液(Reagent G运行1次(30毫升),以达到色谱柱均衡和温度稳定
 
三、标准样品配制
 
1.   准备好51.5毫升离心管,标记为15号管
2.   分别加入xx微升稀释液(Reagent D15号管
3.   移取xx微升标准液(Reagent H1号管,混匀
4.   小心移取xx微升1号管稀释的标准液(Reagent H2号管,混匀
5.   小心移取xx微升2号管稀释的标准液(Reagent H3号管,混匀
6.   小心移取xx微升3号管稀释的标准液(Reagent H4号管,混匀
7.   15号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表
 

管号
稀释液(Reagent D
标准液(Reagent H
TDP
1
xx微升
xx微升
80纳克/毫升
2
xx微升
xx微升1号管
40纳克/毫升
3
xx微升
xx微升2号管
20纳克/毫升
4
xx微升
xx微升3号管
10纳克/毫升
5
xx微升
0
0

8.     分别加入xx微升沉淀液(Reagent C
9.     分别涡旋震荡1分钟
10. 4下孵育10分钟
11. 分别放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g
12. 分别移取上清液到新的1.5毫升离心管
13. 置于冰槽里备用
 
四、色谱分析
 
1.   分别移取xx微升上述配制的标准液(Reagent H和待测样品到新的1.5毫升离心管
2.   分别加入xx微升碱性液(Reagent E
3.   分别加入xx微升氧化液(Reagent F,混匀
4.   放进60培养箱孵育10分钟
5.   置于冰槽里冷却5分钟
6.   分别放进4微型台式离心机离心10分钟,速度为10000g
7.   分别移取上清液到新的1.5毫升离心管(注意:须在72小时内完成测试)
8.   每次(每个样品)注射50微升
9.   每次(每个样品)运行12分钟
10.获得色谱波峰图:波峰面积(peak area)或峰值,保存记录
11.全部运行完成,使用30毫升无离子水清洗色谱柱
 
五、计算含量
 
1.   方法一:通过仪器中的软件进行测算
2.   方法二:构建标准曲线:纵座标(Y轴)为波峰面积(peak area;横座标(X轴)为标准TDP浓度(纳克/毫升)根据标准曲线获得样品对应TDP浓度(纳克/毫升)
3.   方法三:公式计算(选择单一浓度的标准液)
 
样本TDP浓度(纳克/毫升)=【样本波峰面积(peak areaX标准TDP浓度】÷对应标准TDP浓度的波峰面积
 
注意事项
 
1.   本产品为20次操作
2.   血浆或血清样品的TDP含量较低,建议使用全血样品为佳
3.   本产品检测范围是0.5至250纳克/毫升
4.   操作时,须戴手套
5.   试剂具有挥发性,注意密闭瓶盖或使用封口膜
6.   样品建议新鲜采集,避免溶血
7.   正常人体血液中TDP的正常范围为3295纳克/毫升;建议用户建立自身正常范围
8.   沉淀液(Reagent C碱性液(Reagent D流相液(Reagent G标准液(Reagent H具有腐蚀性,注意操作安全
9.   色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等
10.用户可以使用已知浓度的标准液(Reagent G)作为内参标准加入到样品中,检测回收率(recovery
11.TDPHPLC参考图谱如下
 
 
12.TDP的出峰时间(retention)以用户操作时,使用的标准液(Reagent G)实际出峰为准
13.本公司提供系列维生素检测试剂产品
 
质量标准
 
1.   本产品经鉴定性能稳定
2.   本产品经鉴定检测敏感
 
使用承诺
 
秉着信誉至上、客户满意、质量承诺的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。
 
友情提醒
 
IF IT DOESN’T WORK RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG
 
订购信息
 
编号                                       名称                                                                                                        规格          
19067.2.2                     血液维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒           
19067.2.2A                   清理液(Reagent A)                                          100毫升
19067.2.2B                 裂解液(Reagent B                                                          100毫升
19067.2.2C                      沉淀液(Reagent C                                                     10毫升
19067.2.2D                     稀释液(Reagent D                                                          10毫升
19067.2.2E                      碱性液(Reagent E                                                          10毫升
19067.2.2F                      氧化液(Reagent F                                                           10毫升
19067.2.2G                 流相液(Reagent G                                                         500毫升
19067.2.2H                 标准液(Reagent H                                                   1毫升
 

产品编号
名称
规格
19067.2.1
通用型维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.2
血液维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.3
食物维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.4
植物维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.5
细菌维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.6
酵母维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20
19067.2.7
体液维生素B1液相色谱法定量检测试剂盒
20

 
 
 
 
   
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