基因工程疫苗的制备-上海继锦化学科技有限公司

基因工程疫苗的制备

    1. 制备基因工程苗用酶和载体酶是进行基因工程*的试剂。用于基因工程的工具酶主要是限制性核酸内切酶和DNA修饰酶（连接酶），限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类水解DNA的磷酸二酯酶，用于基因工程的限制酶，主要是能专一的识别4～6个核苷酸序列，并有专一的断裂位置或切点的酶，如EcoRI、HindⅢ、PstI、BamHI等。DNA修饰酶是将目的基因的DNA片段与载体DNA分子在体外连接起来，构成重组体DNA分子，这类酶主要有T4DNA连接酶（从T₄噬菌体感染的大肠杆菌中分离出来的）等。
    基因的载体，可以携带外源DNA片段，进入宿主细胞进行增殖和表达，作为基因的载体，应具有以下的特征：能在宿主细胞中自我复制，即使有外源DNA片段与其共价连接也不影响其复制；应具有合适的限制酶识别位点，以便与外源DNA片段连接；应具有某些遗传标记，以便于重组体的选择。常用的载体有质粒（如大肠杆菌质粒pBR322、 pSC101、Co1EI）、噬菌体（λ噬菌体和M₁₃噬菌体）、粘性质粒（由质粒DNA和λ噬菌体的COS区域构建而成，它不但具有以上两种载体的优点，而且能与大片段的外源DNA连接构成重组体DNA分子）及病毒（如牛痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、乳多空病毒等）。

    2.基本程序大致包括以下五个步骤：
    *步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
    第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
    第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞（大肠杆菌、酵母）中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化（以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落）、转染（λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑）、转导（λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞）的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
    第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
    对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从zui初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，zui后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从zui初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。
    第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物（蛋白质），在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。