单克隆抗体的生产、提纯、鉴定与保存 （一） McAb的生产在建立杂交瘤细胞株后，可在体外大量培养，收集上清液而获得大量的单克隆抗体，以旋转瓶培养法为佳。先将细胞用一般静止培养法在5%小牛血清培养基中适应2～3天。将30ml生长旺盛的细胞移至旋转瓶中，加入70ml 25%小牛血清培养液，充以10%CO2的空气，盖紧，37℃静置1～2天后，打开盖，加700ml 25%小牛血清培养液，再盖紧，37℃慢速（1 r/min）旋转，每天打开1次盖，让10%CO2通过一滤菌网与瓶内气体进行交换，当细胞不再生长，1～2天后收集培养液，离心，将上清液保存。用这种方法制备单克隆抗体，比较麻烦，抗体的含量较低。 目前一般多用小鼠腹腔接种的方法进行McAb的制备，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100～1000倍。方法是：取已成年的BALB/c小鼠，于腹腔内注入液体石蜡或降植烷0.5ml，1周后，再于腹腔内注入杂交瘤细胞3×105/05ml，10天左右即形成腹水。待小鼠腹腔明显胀大，用75%酒精消毒腹部，用7号注射针头刺入腹腔下部，然后轻按腹部，使腹水自然滴出，一次可收得约5ml，多者10ml以上，间隔了2天后，可再次抽取，如此反复直至小鼠死亡。抽取的腹水，离心10min，取上清液保存。沉淀中的细胞可再给另外小鼠注射，其形成腹水的速度比原细胞快。为多获得腹水，应选择雌性小鼠，体重以重者为优。 （二） McAb的提纯不论是培养上清液还是腹水，如果用于诊断试验或ELISA等，不需再提纯，如分析抗体的蛋白均一性，或做蛋白定量，则应进一步纯化，以除去培养液、宿主及克隆细胞本身的一些无关 蛋白质。提纯方法与一般Ig的提纯方法相同。 （三） McAb的保存由于McAb对环境因素敏感，其稳定性远不如常规抗体， 如有的McAb经冻干后*失效。培养上清液加01%的叠氮钠防腐剂，4℃可保存数月，由于有小牛血清，不需另加保护蛋白，腹水分装，于-20℃或-70℃长期冻存，用时以含1%BSA，01%的叠氮钠的PBS稀释，其中BSA为保护蛋白，起稳定作用，在4℃还可保存数月，切忌反复冻融。提纯的McAb，加入1%BSA分装后冻存。 单克隆抗体的鉴定 （一） McAb Ig类别及亚类鉴定方法是用兔抗小鼠各种类别及亚类的Ig抗血 清与培养上清液进行免疫双扩散试验，根据出现的沉淀线来确定。由于培养上清液中抗体浓 度较低，不易出现沉淀线，应先浓缩5～10倍。也可用多次加样的方法。 （二） McAb的其他性状鉴定必要时，可针对抗原决定基的属性、特异性、 亲和力及其他生物学特性进行鉴定。 |
