本试剂盒仅供研究研究使用
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、唾液、细胞培养物上清或其它相关液体中MMP-9含量。
概述
MMP-9基因位于染色体20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13个外显子和9个内含子。哺乳类动物MMP-9mRNA的同源性约为80%。MMP-9的启动子区内含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子结合位点，人的MMP-9启动子区还有核因子（NF）κB、ETS结合位点和转化生长因子（TGF）-β抑制元件MMPs主要由3个*的、保守的结构域构成，包括前肽区（氨基末端区）、催化区和羧基末端区（类血红素结合蛋白酶区）。MMP-9是明胶酶中的一种，除了有MMPs的原型结构外，MMP-9的催化区还包括3个重复的型纤维连接蛋白结构域，这个结构域与明胶或弹性蛋白有高度的亲和力。MMP-9包含一个V型的胶原蛋白结构域,这个结构域有高度的糖基化作用，,它影响底物的特异性以及有抗衰变的作用。MMP-9有许多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，细胞因子及其受体也是MMP-9作用的底物。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MMP-9水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗人MMP-9抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成
1.酶联板：一块（96孔）
2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为100 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成100 ng/mL，50 ng/mL ，25 ng/mL，12.5 ng/mL，6.3ng/mL，3.1 ng/mL，1.6 ng/mL，其原液直接作为zui高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
标本的采集及保存
1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。
3.每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4.每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。
6.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层
吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人MMP-9，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2．一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3．请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
4．如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6．底物请避光保存。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．有效期：6个月
3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 |
