本试剂盒仅供研究使用
检测范围：125 pg/ml - 8000 pg/ml
zui低检测限：31.2 pg/ml,
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人VEGF165，且与其他相关
蛋白无交叉反应。
有效期：6 个月
预期应用： ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关
生物液体中VEGF165 含量。
说明
1. 试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2. 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实
验结果造成任何影响。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗VEGF165 抗体的
微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗VEGF165 抗体、HRP 标记的
亲和素，经过*洗涤后用底物TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转
化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的
VEGF165.呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算
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样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板（Assay plate ）： 一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）： 2瓶（冻干品）。
3. 样品稀释液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）： 1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液（Wash Buffer） 1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。
10. 终止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof 管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20 分
钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻
融。
2. 血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8° C
1000 x g 离心15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复
冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g 离心20 分钟，取上清即可检
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测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。
只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应
做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好
后静置10 分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为8000 pg/ml,，
做系列倍比稀释后，分别稀释8000 pg/ml, 4000 pg/ml, 2000 pg/ml, 1000
pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0
pg/ml,，临用前15 分钟内配制。
如配制4000 pg/ml,标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）8000 pg/ml,的上述
标准品加入含0.5ml 样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以
此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所
需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物
素标记抗体加990μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用
前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的
每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如
10μl 辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
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实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀
时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品
稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，
余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于
酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，
37℃反应120 分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl
生物素标记抗体加99μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，
在使用前一小时内配制），37℃,60 分钟。
3. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分钟，
200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）
100μl，37℃，60 分钟。
5. 温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分钟，
200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标
准品的前3-4 孔有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加
入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底
物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。 在加终止液
后15 分钟以内进行检测。
实验备注
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到
管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶
液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD 值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上
盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体
工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请
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勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物
酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上
铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml
注入孔内，浸泡1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对
数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；
再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方
程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即
为样品的实际浓度。
注意事项
1. 本操作说明适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。
2. 底物请避光保存。
3. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
6. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
7. 一次加样时间控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
8. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
9. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释
倍数。